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全国串联质谱技术及中药中禁用农药、黄曲霉毒素检测技术培训班学习心得

发布时间:2020/9/30   来源:药品检验与研究所 翟宏焱 陈荣耀   阅读:5767
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    2020年9月2~4日,我们参加了由中国中药协会主办,中国食品药品检定研究院、河北省药品医疗器械检验研究院、四川省食品药品检验检测院、广州市药品检验所提供技术支持的全国串联质谱技术及中药中禁用农药、黄曲霉毒素检测技术培训班。此次培训班主要培训对象为全国范围内药品检验院所和从事中药材研究、生产、检验和质量控制相关的技术人员。与会专家围绕中药中禁用农药、黄曲霉毒素检测的理论知识和技术要点,针对残留分析,试验操作,仪器使用等工作中面临的实际问题进行了讲解。此次培训班让我受益匪浅。不仅开拓了我的视野,增长了见识,同时也对我的工作有了很大启迪。

    河北省药品医疗器械检验研究院的刘永利副院长对“中药有害残留物检测分析质量控制指导原则”进行了解读。该“原则”是依照法定标准检测中药有害残留物时,方法确认、偏离和日常检验分析质量控制应遵循的主要技术要求。由于中药基质复杂,待测物理化学性质各异,且中药有害残留物检测多属于痕量分析范畴,因此必须建立适宜的分析质量控制体系,保证结果准确可靠。实验室要依据分析方法确认指导原则对法定方法的适用性进行确认。对法定方法的任何偏离应进行评价,这些偏离包括但不限于方法优化、试验参数的调整;我们需要根据偏离对测定结果的影响程度,对偏离的方法重新确认或依据分析方法验证指导原则对偏离的方法进行必要的部分验证或全面验证,这贯穿于我们实验室日常检验工作中(空白试验、灵敏度、准确度和线性),需特别指出的是,残留分析的回收率试验的样品首选与待测样品基质相同或相近、不含目标分析的空白样品。进行回收率试验不必减半取样,以便更好的反应基质对测定的影响。

    中国食品药品检定研究院的刘丽娜老师对“中药中黄曲霉毒素残留量测定法”进行了详细的阐述。就黄曲霉毒素在《中国药典》、《欧洲药典》、《美国药典》检测方法的的异同点、黄曲霉毒素的理化性质、黄曲霉毒素的化学结构、黄曲霉毒素检测法主要步骤等进行了详细的说明。其中最关键的免疫亲和柱净化是利用抗原-抗体免疫反应的原理,使用大剂量的单克隆抗体,选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附,用水或者吐温-20/PBS将杂质洗脱除去,再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱,达到分离净化的目的。同时强调了黄曲霉毒素测定的关键因素:(1)LC-MS-MS体系下,采用[甲醇-乙腈(3:2)]-0.1mmol/L乙酸铵系统,ESI(+)多反应监测(模式)。(2)溶液的含醇量一般低于15%,最高不得超过20%;溶液的浑浊度将影响免疫亲和柱净化;溶液的pH值等。

    四川省食品药品检验研究院的苟琰就“中药材中农药残留污染物现状分析”进行了探讨。目前我们我国农药实行登记制度,对高度高残留品种实行禁限用规定。中药材登记存在的问题是作物群组分类、代表作物选择、田间药效试验点选择等尚未明确可实施方案。我国是农业大国,同时我国也是农药第一大生产国和第一大使用国。我国的农药使用的特点是高消耗、高污染、低效率。目前我国中药材种植总面积约140万公顷,人工种植成为必然。但种植者普遍缺乏植保知识,农药滥用现象时有发生(高浓度、混配、次数频繁),中药有害残留引起了一系列不良事件。不光于此,植物生长调节剂的不合理使用也带来了相当的风险。植物生长调节剂是一类具有植物激素活性的人工合成农药,可用于改善作物品质和调节生长。但使用过量会造成中药材和农作物带来很大不利影响。例如白芷大量使用矮壮素、缩节胺、赤霉素等,性状变异惊人。目前中药材中农药使用的现状是:使用农药现象普遍,部分地区中药材的种植生产处于无序状态;缺少规范,监管几乎为空白。目前残留检测数据现状是:样品农残整体检出率高;一些禁限用农药的检出,可能与土壤污染有关,如六六六、滴滴涕等;一些品种存在安全风险,如人参中的五氯硝基苯、泽泻中的毒死蜱等;部分根茎类药材使用植物生长调节剂情况比较严重。为有效解决这些现状问题,需要大力推动中药质量提升和产业高质量发展。严格农药、化肥、植物生长调节剂等使用管理,分区域、分品种完善中药材农药残留限量标准。

    广州市药品检验所的李纯副主任中药师向我们详细介绍了“中药中禁用农药检测平台的建立及技术特点”。依托“药品审评审批制度综合改革项目”子课题——“中药材和中药饮片中农药残留限量标准研究”,选择10个品种作为研究对象,针对农药的使用及残留情况进行调研及检测,在此基础上最终形成33类禁用农药多残留检测方法。品种选择则是药食同源,具备药用及日常保健功能的“大宗品种”;在中成药及中药处方中使用率高,覆盖面广;形成规模化区域性种植,经济效益高;农药使用的相关报道较多,有较高的关注率;不同的药用部位(根茎、花、叶、果皮、果实)。禁用农药检测平台的方法核心是串联质谱法:LC-MS-MS,GC-MS-MS;三重四级杆质谱仪(QQQ,Triple Q);多反应监测模式(动态MRM);每个待测指标选择至少2对离子进行监测。方法提供的监测离子对测定条件为推荐(参考)条件,各实验室可根据所配置仪器的具体情况作适当调整;在样品基质有干扰的情况下,可选用其它监测离子对。对于特定农药或供试品,分散固相萃取净化管中的净化材料的比例可作适当调整,但须进行方法学考察以确保结果准确。根据供试品基质特点和方法确认结果,选择一种最适宜的供试品溶液制备方法。本平台方法收载了3种样品前处理方式,可根据中药基质的特点灵活选择,操作性较好,部分检测指标同时收载了液质法及气质法,阳性样品可相互交叉验证。

    中国食品药品检定研究院的金红宇主任,花了整整一天时间,详细讲解了“中药材农药多残留检测中的样品前处理技术”、“中药材禁用农药多残留检测技术”。中药中农药残留测定主要特点为:检测指标达数百种,且性质各异;痕量残留检测,灵敏度要求高;中药药用部位复杂,基质类型多样,干扰各不相同;一般药材含水量低,贡提取杂质多,对测定有严重干扰;遵循风险评估的科学要求,方法要具有一定的适用性,成本可控。而中药中禁用农药残留检测面临的现实技术问题有:要求最高的检测灵敏度;基质效应对测定干扰严重,直接影响了测量的准确性;药典提供了通用性方法,但单一的前处理手段又难以适用于所有药材的检测;农残检测分析成本高,检验单位需要建立合理的检验策略,并通过规范化的实验室管理,提升效率、降低成本;需要开发自动化、智能化前处理和检测技术;需要正确理解风险评估的基本原理,遵循科学、适用的分析质量保证体系,既要保证检测结果可靠、数据可信,又要合理化的控制检测成本。植物药材中禁用农药多残留检测平台包括提取、净化、检测三个重要环节。这一切的前提是我们的取样要有代表性。提取则包括高速匀浆、高速振荡、QuEChERS法、超声提取,加速溶剂提取,每种方法有各自的优势与不足。超声提取效率高、时间短、适应性广,样品处理量大,可同时操作多个样品,但超声波衰减因素明显,不同频率、不同位置效率可能不同,且超声可能导致一些成分的降解。高速匀浆优势在于可以达到破壁的效果,高效率,自动化,但需要配备充分的冲洗过程,防止交叉污染,同时在采用极性溶剂处理高油脂样品时,容易黏连。当处理高硬度、高纤维性样品时,应事先充分预粉碎。加速溶剂萃取溶剂选择和萃取次数灵活,全自动进行,溶剂用量少,萃取时间短,不同基体可用相同的萃取条件。但因其在较高的温度(50~200℃)下运行,多种农药无法耐受,且因提取效率太高,在提取农药的同时,杂质也相应成倍增加,因此不适合作为农药残留的前处理条件。不论是GPC、SPE还是现在推崇的QuEChERS法净化包,其目的都在于减少杂质峰对测定的干扰,降低基质效应,减少系统污染,保证分析稳定性,降低维护成本。样品基质较少、有色素等的干扰、基质效应明显,有较多色素干扰,均可以采用QuEChERS法;如果有大量杂质,尤其是挥发油干扰,均采用固相萃取(HLB)法;基质复杂,叶绿素等色素较多,则采用固相萃取(氨基-石墨化碳复合柱)法。三重四级杆系统能够减少样品处理,缩短分析周期,消除错误结果,简化数据浏览,提高效率,可以应对复杂基体分析;实现超痕量分析。与定性相关的技术要求:保留时间一致,供试品中监测离子对都出现,且峰面积比与对照品监测离子对峰面积比在±20%以内,在关键时刻会排除假阳性干扰。提升监测灵敏度关键在减少基质干扰,简化前处理操作,并且需要优化质谱参数(方法开发)、调谐质谱并设置适宜的电压,设置适宜的积分参数(设置合理的平滑参数),时常注意仪器的日常维护(色谱柱维护、进样衬管、进样隔垫、离子源、真空泵、进样针等)。校准曲线的绘制则是与定量的相关的技术要求,线性范围一般无需强制通过原点,相关系数一般不低于0.990,线性范围较宽时,建议采用加权校准法。基质效应是在对分析物的浓度或质量进行测定过程中,来自样品中其它化合物的一种或几种综合的影响,分析物在基质存在的情况下相对于纯溶剂当中有不同的响应,可能是使吸收信号增强,也可能是减弱。其特点是:多数情况下难以或不能被忽略;倾向于多变而且难以预知;不但不同基质,而且基质浓度不同,其影响也不同,极大影响残留分析准确性。在气相色谱中多表现为基质增强,液相色谱中多为基质减弱。通常,基质效应在80~120%范围内,可认为基质效应影响较少。减少基质影响的几种方法:采用基质匹配标准溶液校准、多步净化、添加内标、采用分析保护剂

    随着民众健康意识的加强,中药的应用日益广泛,其安全性问题引起社会高度关注,以《中国药典》为代表的相关法定标准日益完善,对药品生产企业和检验单位的检验能力提出了更高的要求。作为药检机构的检验人员,一定要紧跟检验检测前沿技术,奋发图强,刻苦专研,把握检验检测的技术脉搏,将所学的知识应用的工作中,为我院高质量发展贡献力量!

 


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