2019年11月23日至27日，我们微生物室一行三人参加了由中培质联质量技术培训中心举办的“维生素检测国标方法微生物法检验实验操作技术”高级培训班。目前我室承担的国本级婴配粉中的叶酸、泛酸、生物素、维生素B12的国标方法均为微生物法，众所周知，微生物法灵敏度高，但是操作复杂，且部分关键步骤需要实验室摸索确定，方法建立难度相对较高，我们在前期的检验过程中也遇到了许多问题，亟待解决。此次课程由婴配粉牵头单位国家食品质量安全监督检验中心生物室主任蔡雪凤老师讲授，蔡老师从事维生素检测已有十多年，经验丰富，在几天的培训中，她将四种维生素检测中的注意事项和关键控制点都毫无保留地传授给大家，并解答了我们的很多疑问。大家在老师的指导下，从样品处理到结果计算，实际操作完成了叶酸和生物素两个项目的实验。通过理论和实操相结合的学习方式，加深了我们对标准的理解，开拓了优化实验条件的思路，此次培训对于提升我们维生素检测能力起到了很大的帮助，现将一些学习心得分享如下：

    国标方法的主要原理为：利用特定菌种生长对相应维生素需求的特异性，在一定控制条件下，将菌液接种至含有试样的培养液中，根据维生素含量与透光率（或吸光度值）的标准曲线计算出试样中维生素的含量。国标方法中操作步骤主要有菌液的制备、标准曲线制备、样品的提取稀释和pH调整、接种培养等, 步骤多，容错率低，每一个操作步骤失误都可能直接影响结果，造成实验失败，因此需要我们在每一步操作中都要把握住关键点。

    一、器皿的清洁

    实验中使用的玻璃器皿中可能含有抑菌、促生长或破坏特异性灵敏性等物质，会影响菌株与标准物质的正常反应，因此器皿的清洁度对检测结果有直接影响。直接接触检测体系的试管、容量瓶、三角瓶等容器一定要清洗干净，尽量去除玻璃器皿内壁附着的样品残渣或清洁剂污渍，做到无残留。器皿的清洁流程一般为：实验室专用清洗剂清洗去污－沸水煮－酸泡－蒸馏水冲洗－200℃左右烘干2h ，冷却备用。实验过程所用的玻璃器皿较多，实验前要计算好器皿的使用量和实验时间，以确保有足够的洁净器皿用于实验。

    二、菌液的制备

    实验的原理是利用特定菌株对维生素的特异性反应，因此菌种的活性和特异性是保证实验成功的先决条件。实验室应建立菌种传代、保藏标准流程，定期验证菌种活性。但是现行国标中并未明确规定菌种保藏步骤，老师建议可用甘油肉汤在-20℃或-80℃冰箱保藏处于对数期生长阶段的测试菌种，效果较好，且保藏菌种活性强，取出后可直接应用于测定。在制备工作菌液时，需要将培养肉汤离心、用清水清洗两遍（洗去培养液中营养物质的干扰）后再使用。在实验室实践中，应先摸索测试菌种在添加了对应维生素的测定用培养基中的生长曲线，得到菌种对数期或稳定期的生长时间，随后配制标准曲线探索最终加菌量对测定结果的影响。

    维生素B12使用的莱士曼氏乳酸杆菌，生长较为困难，厌氧环境可以延长保存时间、活性。所以菌种除了在测试试样时培养可以无需厌氧条件时，其余的培养、保存过程需要厌氧环境才能保存其活性和特异性。

    三、标准溶液的制备

    标准品要按要求合理保存，打开的固体纯品要注意温湿度、避光、存储器皿洁净度、密封性等。标准品的纯度不符合标准要求的要乘系数。配标液的时候注意计算称取的量，一般都是很微少的量，用分析天平称量的时候要准确，最好关门关窗，不要有过多的走动，注意不要交叉污染。在制备时可以移液枪或移液管，最好一次性的，避免污染。应用质控样核查标准溶液浓度是否准确，或用已确认的浓标验证中间液。所有标准溶液要储存于冰箱内冷藏避光保存,标准曲线工作液临用前配制。

    四、样品的提取

    国标要求试样系列管中待测维生素含量尽可能落在标准曲线范围内，通常需要根据样品标签值来估算所需称取的样品的量及稀释倍数，操作中注意计算稀释倍数，以免稀释过程中出现错误，多次稀释时也要注意减少误差，不然对后面的实验结果产生较大的影响。

    生物素和B12的样品提取需要调节pH，生物素水解添加了3％硫酸100mL，需要先用浓NaOH预调，再用0.5mol的NaOH微调，用于水解样品的硫酸浓度（3%）较高，高压水解样品用的高压锅要专用，定期检测高压锅内水的pH值，勤更换，确保安全。维生素B12提取用的偏重亚硫酸钠会对菌株有促生长作用，应考虑在反应中扣除或在标准溶液中添加和样品同等浓度的偏重亚硫酸钠。

    五、培养基的制备

    按标准要求准备，培养基购买成品测定培养基。按实际需要量配制，有一定富余，称取培养基＋水，按产品要求煮沸溶解，按产品要求灭菌，分装。要注意培养基厂家要求灭菌时间与标准中不一致时应以厂家说明书的为准,时间过长，会使培养基变色，影响实验结果，灭菌后要迅速冷却试管，可以放在冰水里面冷却，否则培养基颜色变深也会影响实验结果。

    六、接种培养

    试管架用不锈钢的或其它可高压不氧化的，避免灭菌时氧化变质，避免使用铝制试管架。在添加菌液时，由于实验中所需的试管太多，可将菌液直接添加到灭菌后的测定培养基充分混匀后无菌分装到标准曲线／样液待测管。可以提高效率，并避免菌液滴加挂壁。接菌量和培养时间要根据菌的活性来确定，需要各个实验室自行摸索实验条件确定。

    七、测定计算结果

    培养结束后测吸光度或透光率值，需要利用涡旋振荡器充分混匀（利用点阵法，多次混匀），待测管比色前要混匀均匀尽量每只试管混匀、比色读数时间一样。结果计算时，国标中并未表述标准曲线绘制拟合方法，实际检测中既可以使用直线拟合方法，又可以采用四参数法拟合，在EXCEL中，使用直线拟合方法可以较简便地处理数据，也可使用专业绘图软件利用四参数法拟合直接求得待测液含量。

    八、试验成功几个指标

    1.标准曲线成规律的梯度生长，且绘制曲线的点满足标准要求。

    2.每批试验带双平行质控样品，结果符合指定值。

    3.称取双份样品检测结果满足标准要求，每只试管测定浓度值不应该超出15%。

    结合这次的学习成果，我们将继续努力提高检验技能，不断优化实验条件，争取将维生素检测做得更加纯熟精准。