2018年11月1日，我们参加了拜发分析系统销售（北京）有限公司联合上海必优生物科技有限公司举办的B 族维生素试剂盒培训会议。此次会议邀请了数位专家进行理论讲解和实际操作指导，还邀请了华东地区和上海市各出入境、食药、质检、疾控中心、第三方检测机构、特医食品、保健品、知名婴幼儿乳粉企业等27家单位的55位检测一线专家和老师。会议时间虽然短，但内容紧凑丰富，让我们对该领域的学习更加深入，开拓了视野，也积累了更多经验。

    清华长三角研究院任一平教授首先简单介绍了真菌产生霉菌毒素及毒性的基本理论知识、2016版真菌毒素检测方法标准以及GB 2761各个版本的修订历程。接下来，任教授重点讲解了霉菌毒素检测新国标GB2761-2018的制定过程。此次国标修订，广泛吸取采纳了各方意见，将对目前的霉菌毒素国家标准进行整合和完善，修改的GB2761-2018 将对黄曲霉M1限量提出新的要求。任教授还逐一讲解了新版国标中各种真菌毒素检测方法与老版方法的对比，通过列举方法学验证研究以及实验室对比的实验数据，分析方法利弊。

    经验丰富的 B 族维生素检测专家上海海关高级工程师王赢老师，为大家讲解了B 族维生素 GB 国标方法、试剂盒方法的对比及试剂盒使用的亲身体验。依据目前我国国家标准，维生素分析方法有微生物法、荧光分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法等。微生物分析法根据某种维生素是某种细菌生长所必需的原理，利用比浊法或酸度滴定法测定细菌繁殖程度或代谢产物，间接对该维生素进行定量测定。该方法以其经典性、准确性以及广泛适用性，成为许多国际机构作为部分维生素分析的标准方法或第一方法。例如：到目前为止，美国分析化学家协会（AOAC）以及《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B 12 的测定》都将微生物法作为维生素B 12 检测的首选方法和仲裁方法。由此可见，微生物法应用较为广泛。微生物法反映的是基质中总维生素的含量，这是微生物法区别于其他方法的最大特点，也是仪器分析方法很难做到的。

    尽管微生物法灵敏度高，但具有很多局限性。如整个实验周期长，批次检测结果重复性差，检测结果误差大。微生物法检测过程中偶然性因素很多，如样品中含有抗生素或其它抑菌物质、样品中维生素含量与预期的有所不同而选择了错误稀释浓度、检测环境中没有达到严格无菌要求，试验用菌株品质的优劣，培养基及培养试剂的质量，操作人员是否具备足够的相关操作经验等诸多因素都会导致实验的失败。通常微生物法测定过程中使用试管进行培养，在大批量样品检测时，则需要使用大量的试管，工作量非常大，且测定系列管的制备要求较高，如清洗不彻底也会影响结果的准确性。由于传统微生物方法复杂、不易实施，据了解目前只有少数实验室在传统微生物方法检测维生素方面做得较好，且投入了大量的人力和精力。目前食品中的叶酸和生物素的检测标准GB5009.211-2014、GB5009.259-2016已引入了试剂盒方法，泛酸和维生素B12仍需使用传统微生物方法进行检测。

    德国拜发开发的维生素检测试剂盒，采用与国标完全相同的原理和菌种，将标准菌种固定在微孔板内，以最佳状态等待后续的检测，解决了菌种纯净和稳定的问题，检测所需要的所有试剂和操作均已标准化，省去了配置培养基、购买和保存菌种、接种等大量耗时且繁琐的工作和相关费用。96孔酶标板的引用大大降低了工作强度。检测准确率较高(偏差系数＜10%)，标准参考样品的回收率可达90%-105%。与传统微生物检测法相比具有检测周期短、操作步骤简便、结果重现性高的优势。

    德国拜发技术工程师葛丽花老师重点讲解了试剂盒操作过程中的要点及关键控制环节，分析了一些实验案例和解决方法，让大家受益匪浅，大大提高实验效率和准确性。

    1、在高压灭菌锅灭菌的过程中，一同灭菌的其他耗材里可能含有的维生素，被蒸汽携带而扩散开来，可能污染本次一同灭菌的耗材，因此使用无菌的实验耗材，不要使用高压灭菌锅去灭菌耗材；若重复使用的实验耗材，也可能产生维生素的残留，残留的维生素会被带入到后面的检测中，并通过结果计算时稀释倍数的计算过程而大比分放大，实验耗材也不要重复使用。

    2、对培养基和样品提取液进行加热的水浴锅，确认水浴的温度 至少为 95 °C, 更高的温度更好，要保证培养基和样品提取液的中心温度达到95 °C。

    3、样品稀释要在无菌、未经高温灭菌锅灭菌的离心管中进行稀释，始终使用试剂盒中配备的无菌双蒸水。若样品提取液带有一层，非常粘稠，或者枪头上挂有一滴液珠：不要将枪头伸入水中，第一步后直接丢弃枪头。若要做更高级数的稀释，则选2 次每次1：10的稀释，而不选择1次1：100的稀释。

    4、在板架内置入8道微孔板条尽量不使用板架第一条的位置，避免因后续膜盖板时没有盖紧而导致孵育过程中出现液体的蒸发损失。

    5、孵育时不要将微孔板层叠放置，将微孔板尽可能地放置在孵育箱的中间位置，避免经常性地开关孵育箱，或在孵育过程中敞开孵育箱时间过长，确保孵育温度恒定不变。

    6、OD 值测量时将板翻转过来，覆盖膜的一面紧贴桌面，在桌面的水平面上进行平移或圆周运动，进行空中液体的震荡，气泡可能会影响 OD 值在酶标仪读数前将气泡戳破。

    在培训会的实际操作部分，德国拜发的技术人员与参会人员一起共同进行了叶酸检测试剂盒的实验操作。实验过程中，与同行们和技术人员互相交流平时实验中遇到的问题，气氛非常热烈，针对性的解决了我们遇到的实验问题。本次会议将理论与实践、专家讲解与客户讨论相结合，提供了一个良好的学习机会和交流平台，也为以后我们继续深入学习维生素检测技术打下了良好的基础。