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标准菌株保藏管理与质控样品应用评价培训心得

发布时间:2018/6/8   来源:食品所微生物检测室 刘娟娟   阅读:469
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    为提高本实验室对标准菌株的管理、确认和保藏技术水平,提升对微生物质量控制结果的评价能力,5月24、25日,我参加了由中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)举办的“标准菌株保藏管理与质控样品应用评价专题培训”。来自实验室一线的专家,CICC的高级工程师李金霞、都海渤、胡海蓉、葛媛媛老师和北京陆桥的质控主管刘沛,针对标准菌株的概念和相关法规进行了详细解读,并开展标准菌株复活培养、保藏和质控样品结果评价等实际操作培训,现场还参观了国家级菌种保藏中心菌种保藏库和微生物检测、鉴定与评价实验室,短短两天却获益良多。

 

    一、标准菌株的管理

    目前,我国对微生物检测实验室标准菌株的管理与应用日益规范,2018年3月1日,中国合格评定国家认可委员会(CNAS)发布新版CNAS-CL01:2018《检测和校准实验室能力认可准则》以及相关领域的应用说明,对微生物检测实验室标准菌株管理提出了更高要求。实验室应从程序文件的建立、仪器设备配置与人员培训、合格供应商的选择与评价、标准菌株的购买、确认、使用、保藏、废弃物的处置等几个方面做好标准菌株管理工作。标准菌种来源要来自国内外认可的菌种保藏专门机构或专业权威机构,具有可溯源性,CNAS-CL01:2018要求标准物质的生产者要满足ISO 17034的要求,采购标准菌株时要确认菌株供应商的资质。标准储备菌株应在规定的时间转种传代,并做确认试验,包括存活性、纯度、实验室中所需要的关键特征指标如典型形态特征、典型生化试验和血清学等。实验室应建立标准菌株管理文件化制度,做好菌株的领用登记、传代记录、确认试验、销毁、设备监测等记录。

 

    二、标准菌株保藏技术

    菌种保藏就是将微生物菌种用适宜的方法妥善保藏,避免死亡、污染,保持其原有性状基本稳定,原理主要是运用干燥、低温和隔绝空气的手段,降低微生物菌株的新陈代谢速度,使菌体生命活动处于半永久性休眠状态。为成功保藏及使用菌株,不同菌株应采用不同的保藏方法,主要保藏方法有定期移植法、-80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法和真空冷冻干燥法。由于微生物的多样性,不同微生物对不同的保藏方法有不同的适应,应根据菌株的特性、菌株的使用特点和实验室的现有条件选择保藏方法。

 

    三、标准菌株存活性及纯度检验与形态学确认

    标准菌株存活性检验是将采用不同保藏方法保存的培养物接种于适当的培养基,在合适的条件下培养,观察是否生长以判断其是否存活。纯度检验即通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。细菌的纯度检测从三个方面做:菌落形态上观察同一平板上单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似;细胞形态上在对数生长期培养物的革兰氏染色反应应呈现一致性,细胞形状、大小应相似,荚膜、鞭毛数量和着生位置、运动性特征应一致;检测培养物是否形成芽胞,芽胞的大小、位置、形状应相似。

 

    四、实验室质控样品应用要求与效果评价

    质控样品是常用实验室检测分析质量控制的验证样品,是指将已知量的待测物加入到样品介质中配制而成,主要用于方法确认和质量控制,质控样品要经过均匀性和稳定性检验合格后方可使用,对溯源性和不确定度不做要求,质控样品不能替代标准菌株。质控样品的均匀性水平应小于预期测量过程的标准偏差,或小于一个固定的评判值,此值与实验室性能评价或实验室结果“正常”可接受的要求相对应,稳定性应至少覆盖预期的应用周期。CNAS-CL01:2018中要求,针对微生物定量检测项目,应定期使用有证标准物质/标准样品(如菌落总数标准物质、大肠菌群标准物质等)进行监控,或使用质控样品开展内部质量控制活动。针对微生物定性检测项目,应定期使用标准物质/标准样品、质控样品或用标准菌种人工污染的样品开展内部质量控制。实验室间比对或内部质量控制应预先设定评价依据,没有评价依据的质量控制没有意义。实验结束后,根据评价依据对质控结果做出判定。通过比对发现问题及时纠正,从而持续保持实验室的检测质量。质控样品结果评价的方法主要有:利用质控样品证书进行评价;利用方法本身精密度;z值法;临界值(CD值法);MPN计数法评价等。

 

    五、培养基质控要点

    培养基的质量是保证检验结果准确性、科学性、公正性的根本。目前我国的培养基质控标准,  主要为GB 4789.28-2013《食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》,也有行业标准SN/T 1538.1-2016《培养基制备指南第1部分: 实验室培养基制备质量保证通则》和SN/T 1538.2-2016《培养基制备指南第2部分: 培养基性能测试实用指南》。GB 4789.28-2013提供了定量法、半定量法和定性法三种质控方式,对于实验室购买的商品化培养基和试剂的质控,一般选择半定量法和定性法即可。生长率是用来测试培养基对目标菌的促生长能力的, 选择性是用来测试培养基对非目标菌的抑制能力的,而特异性是用来测试培养基的指示能力的。实验人员需要按照GB 4789.28-2013附录E《实验室使用商品化培养基和试剂的质量控制标准》的要求分别对培养基进行性能测试。对于购入的商品化培养基需要生产厂商提供质检报告,  质检报告中含有理化指标以及微生物性能测试指标, 实验人员需要检查培养基粉末或颗粒的外观、色泽以及溶解后的澄清度、pH 值以及固体培养基凝固后的凝胶强度是否与提供的质检报告相符,  来判断该培养基是否满足实验要求。制备培养基时,要控制配制用水的pH值否则可能造成培养颜色异常、产生沉淀或凝胶强度下降;要根据培养基成分的不同,选择适宜的灭菌方式。另外,培养基称重和溶解时,要注意加水的方式,尽量摇匀避免培养基粘在容器上,分装体积避免过大或过小防止培养基灭菌不足或过度灭菌。日常检验过程中要规范培养基的使用, 不断完善和提高培养基的质控水平。

 

    通过专家老师们对技术难点及实际操作技巧的深入讲解,以及培训中与同行们的技术交流,解决了我们在标准菌株和质控样品应用评价中的一些疑问,我会将此次所学迅速融入到工作中,不断提升标准菌株管理和微生物质控水平,更好地为食品微生物检验工作服务。


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